通心络对大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的影响

目的探讨通心络（Tongxinluo，TXL）对同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）诱导大鼠心肌微血管内皮细胞内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）致细胞凋亡的影响及其机制。方法采用植块法原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞，倒置显微镜观察细胞形态并通过CD31免疫荧光法对培养的大鼠心肌微血管内皮细胞进行辨别、鉴定。取2~4代生长良好的大鼠心肌微血管内皮细胞，采用免疫荧光法检测葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）表达以确定Hcy最佳作用时间。后续实验分为5组：空白对照组、Hcy诱导组（Hcy 10 mmol/L，10 h）、Hcy+TXL组（Hcy 10 mmol/L+TXL 400 μg/mL）、Hcy+LY294002组（Hcy 10 mmol/L+ LY294002 5 μmol/L，LY294002为PI3K抑制剂）及Hcy+ LY294002+TXL组（Hcy 10 mmol/L+ LY294002 5 μmol/L+ TXL 400 μg/mL）。采用流式细胞仪检测大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡率，实时荧光定量反转录PCR（Real-Time Reverse Transcription PCR，RT-PCR）及Western blot法检测GRP78、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，Caspase-12）mRNA及蛋白表达，Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇3－激酶（phosphorylation of phosphatidylinositol 3-kinase，P-PI3K）、总磷脂酰肌醇3－激酶（total phosphatidylinositol 3-kinase，T-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation of kinase B，P-Akt）及总的蛋白激酶B（total kinase B，T-Akt）蛋白表达。结果确定Hcy作用时间为10 h。与空白对照组比较，Hcy诱导组细胞凋亡率（22.77%）升高，GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达升高，P-PI3K和P-Akt蛋白表达降低，P-PI3K/T-PI3K及P-Akt/T-Akt降低（P<0.05， P<0.01）；与Hcy诱导组比较，Hcy+TXL组细胞凋亡率（10.17%）降低，GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达降低，P-PI3K和P-Akt蛋白表达升高，P-PI3K/T-PI3K及P-Akt/T-Akt升高（P<0.05， P<0.01）；与Hcy+TXL组比较，Hcy+TXL+LY294002组细胞凋亡率（17.9%）升高，GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达升高，P-PI3K和P-Akt蛋白表达降低，P-PI3K/T-PI3K及P-Akt/T-Akt降低（P<0.05， P<0.01）。结论通心络可抑制Hcy诱导的ERS致大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。

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