龟鹿二仙胶诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化作用及对Wnt通路的影响

目的观察龟鹿二仙胶含药血清对SD大鼠骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）成骨分化的作用及其对Wnt信号通路相关因子的影响。方法 100只3月龄雌性SD大鼠经腹腔入路切除双侧卵巢，按随机数字表法分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白组，每组25只。按体表面积换算龟鹿二仙胶剂量并灌胃给药，连续7天后腹主动脉采血制备含药血清。1月龄SD大鼠全骨髓贴壁法分离BMMSCs，流式细胞法（flow cytometry，FCM）法检测F3代细胞CD45和CD90表达；不同浓度龟鹿二仙胶含药血清干预F3代BMMSCs 72 h后，FCM法检测细胞周期的影响并计算增殖指数，确定最佳干预浓度。F3代细胞分为FBS组、空白组、龟鹿二仙胶组和经典诱导组，诱导培养21天后，茜素红（alizarin red staining，ARS）染色法观察BMMSCs成骨分化，RT-PCR检测成骨分化相关基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）和骨钙素（osteocalcin， OC）mRNA的表达；RT-PCR和Western blot检测Wnt5a、β－连环蛋白（β-catenin）、淋巴样增强因子－1（lymphoid enhancer factor-1，Lef-1）mRNA和蛋白的表达。结果 F3代细胞CD45阳性表达率为1.46%±0.23%，CD90阳性表达率为96.97%±3.21%；浓度为10%的龟鹿二仙胶中剂量组含药血清能显著促进BMMSCs增殖；龟鹿二仙胶组和经典诱导组ARS染色可见橘红色钙结节。与空白组及FBS组比较，龟鹿二仙胶组和经典诱导组OC和ALP mRNA表达上调（P<0.05），Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白表达上调（P<0.05）；与空白组、FBS组和经典诱导组比较，龟鹿二仙胶组Lef-1 mRNA和蛋白表达均升高（P<0.05）；与FBS组和空白组比较，经典诱导组Lef-1蛋白表达上调（P<0.05）。结论龟鹿二仙胶含药血清具有促进BMMSCs增殖，诱导BMMSCs向成骨细胞分化的作用，其机制可能与调控Wnt信号通路相关因子的表达有关。

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